細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的常見問題

　　細(xì)胞冷凍保存是細(xì)胞保留的主要方式之一。借助冷凍技術(shù)，將細(xì)胞置于-196℃的液氮中，可使其暫時脫離生長狀態(tài)并保持其細(xì)胞特性，以備日后在實(shí)驗(yàn)中復(fù)蘇使用。這一方法不僅可以預(yù)防正在培養(yǎng)的細(xì)胞遭受污染或其他意外情況而導(dǎo)致種群喪失，同時也發(fā)揮了細(xì)胞保護(hù)的功效。那么你知道細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的常見問題嗎？讓我們一起來看看吧！

　　一、細(xì)胞凍存為什么要添加保護(hù)劑

　　細(xì)胞凍存是將細(xì)胞放在低溫環(huán)境，減少細(xì)胞代謝，以便長期儲存的一種技術(shù)。

　　細(xì)胞在不加任何保護(hù)劑的情況下冷凍，細(xì)胞內(nèi)外的水分會很快形成水晶從而引發(fā)一系列的不良反應(yīng)：首先，部分蛋白質(zhì)因局部電解質(zhì)濃度增高和pH值改變而變性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。其次，細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成和細(xì)胞膜系統(tǒng)上蛋白質(zhì)，酶的變性等會限礙細(xì)胞的能量代謝。再次，胞膜上的類脂蛋白復(fù)合體在冷凍中易發(fā)生破壞引起胞膜通透性的改變，使細(xì)胞內(nèi)容物喪失。最后，隨著冷凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造成DNA的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷從而引起細(xì)胞死亡。添加冷凍保護(hù)劑可以很好的改善細(xì)胞的破壞與死亡情況。

　　二、冷凍管應(yīng)如何解凍

　　從液氮中取出細(xì)胞置-80℃冰箱中數(shù)分鐘，讓管中液氮控發(fā)后，再放入37℃的水浴鍋中(預(yù)防凍存管爆裂，凍存管內(nèi)有液氮的話，直接放入37℃水浴鍋中可能爆裂)。

　　輕搖凍存管使其最好在2min內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過凍存管管口，否則容易造成污染。

　　三、高效進(jìn)行細(xì)胞凍存應(yīng)該注意什么

　　1.緩慢冷凍：慢凍可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞不會因產(chǎn)生大的冰晶而受到損害。相反，細(xì)胞內(nèi)若出現(xiàn)大結(jié)晶會引起細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。

　　2.細(xì)胞活力及濃度：細(xì)胞應(yīng)在生長良好、培養(yǎng)瓶致密度約為80-90%、活力達(dá)90%以上的狀態(tài)下凍存。細(xì)胞活力差的細(xì)胞在凍存后的成活率很小，因此，一定要在細(xì)胞旺盛分裂時期凍存。

　　3.凍存密度：凍存時細(xì)胞密度少于5x105個活細(xì)胞/mL時，很難成功復(fù)蘇。

　　4.凍存管蓋子：凍存管的蓋子一定要擰緊，否則水浴復(fù)蘇時水會滲入造成污染。

　　5.凍存時間：細(xì)胞不可長期保存在-80℃冰箱中。建議在-80℃冰箱中的保存時間不要超過48h（一般只需要12小時過夜即可）。

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